自從以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)被發(fā)明以來，有一個詞就像幽靈般盤旋在這個領(lǐng)域中，那就是“脫靶”。人人都討論它，人人都害怕它，但卻沒人看得到它。
　　然而在昨天，這個幽靈終于被人抓住了，中科院神經(jīng)所楊輝實驗室團(tuán)隊與合作者開發(fā)了一套名為GOTI的新技術(shù)，讓基因編輯的脫靶從此無所遁形，相關(guān)論文發(fā)表在3月1日的《科學(xué)》（Science）上['1']。

GOTI新技術(shù)讓基因編輯的脫靶從此無所遁形。

　　一槍打在了別人的靶子上
　　在2004年雅典奧運(yùn)會男子50米步槍三姿決賽中，美國選手埃蒙斯遙遙領(lǐng)先，到了要打最后一槍的時候，他已然遙遙領(lǐng)先第二名整整三環(huán)。勝卷在握的他屏息凝神開了這一槍，又一次把子彈準(zhǔn)確送到了差不多是靶心的位置，然而他的記分牌上卻顯示出一個匪夷所思的成績：
　　脫靶。
　　原來埃蒙斯犯了一個莫名其妙的錯誤——他最后一槍打在了別人的靶子上。
　　埃蒙斯：我怎么會……圖片來源：GETTY IMAGES埃蒙斯：我怎么會……圖片來源：GETTY IMAGES
　　奧運(yùn)會的頂尖選手如此，生命科學(xué)的頂尖技術(shù)亦是如此。
　　近年來很火的技術(shù)“基因編輯”，就有這個問題。盡管以CRISPR/Cas9等為代表的新一代基因編輯以精確著稱，但它們時不時就是會犯這種“打到別人靶子上”的毛病——我們本來要讓它去編輯A基因，但它卻意外搞壞了B基因。
　　基因編輯的脫靶和奧運(yùn)選手的脫靶一樣都是極小概率的事件，但常在河邊走哪能不見鬼，每一次基因編輯操作，本質(zhì)上都是成千上萬的基因編輯工具對著成千上萬的細(xì)胞做了成千上萬次編輯，焉能保證次次不失手呢？
　　奧運(yùn)選手脫靶最多丟塊金牌，基因編輯脫靶了，丟的沒準(zhǔn)就是性命了。然而基因編輯技術(shù)宛如一輛勢不可擋的戰(zhàn)車，正以雷霆萬鈞之勢向著臨床領(lǐng)域疾馳而來。
　　然而這歷史的車輪真的不能擋嗎？又該不該擋一下呢？
　　查明脫靶率可沒那么容易
　　還是拿奧運(yùn)會打個比方吧，雖然奧運(yùn)選手脫靶是個小概率事件，但是只要觀察的次數(shù)足夠多，就能夠統(tǒng)計出他平均中靶多少次會出現(xiàn)一次脫靶，這個就是就叫做“脫靶率”。
　　知道了脫靶率，我們才能制定一個標(biāo)準(zhǔn)。比如說規(guī)定平均一萬槍內(nèi)不能出現(xiàn)超過一次脫靶，張三脫靶率是千分之一，那他就不合格；李四脫靶率千萬分之一，那他就值得信賴。
　　然而頗顯尷尬的是，這么多年來，無論是支持基因編輯脫靶還是反對基因編輯脫靶，大家很大程度都只憑著一種“信仰”，卻從來沒有人真正弄清過基因編輯的脫靶率到底是多少。
　　這是因為，基因編輯的脫靶率真的太難檢測了。
　　射擊運(yùn)動員的脫靶率可以直接“數(shù)”出來，基因編輯的脫靶率該怎樣計算呢？也許有人會說，這很簡單呀，把一批樣本分成兩組，一組做基因編輯，一組不做，然后比對一下兩組的基因差異不就成了么？
　　2017年， Bassuk等幾位科學(xué)家還真就這么干了['2']，他們用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯了幾枚小鼠的受精卵，等這些受精卵發(fā)育成小鼠出生后檢測了它們的基因，并將其與同一品系的其它小鼠作對比，結(jié)果居然發(fā)現(xiàn)了“一千多處難以預(yù)料的基因突變”。
　　盡管這個結(jié)果立馬成了各大媒體的頭條，但它卻受到了學(xué)術(shù)圈內(nèi)一致的口誅筆伐，因為這個檢測犯了一個很低級的錯誤：世界上沒有兩只基因完全一樣的小鼠。Bassuk的實驗無法區(qū)分比對出來的基因差異究竟來自于基因編輯，還是小鼠之間本來就有的個體差異。
　　在一片指責(zé)聲中，來自中科院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝實驗室的博士后左二偉（還記得嗎？就是那個敲染色體的 CRISPR又有新用場了！這或許是唐氏綜合征患者的福音 ）卻萌生了一個清奇的想法，當(dāng)時他一拍大腿說，艾瑪好機(jī)會啊，只要立刻用非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)方法重做一下論文的工作，然后得出否定的結(jié)論反駁它，不就白撿一篇Nature methods嘛。
　　做著做著，他就發(fā)現(xiàn)，這個“非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)方法”其實并不簡單（不然早幾年全世界的科學(xué)家不就早該做了么）。更慘的是，他的工作鋪開沒過多久，Bassuk的論文就被撤稿了（詳情請見：震驚！國際頂尖期刊宣布CRISPR有毒！震驚again！它又撤稿了！）。
　　不過，左二偉博士還是決定研究下這個問題，世界上不是有一句魔咒叫做“來都來了”嘛，順便做做看吧……
　　經(jīng)過與導(dǎo)師的討論，一個可以精準(zhǔn)檢測脫靶的方案還真的慢慢成型了。然而正是在左二偉博士“順便”研究脫靶問題的這段時間里，基因編輯臨床化的腳步卻在日益加快。
　　2018年1月，美國批準(zhǔn)了賓州大學(xué)一項利用CRISPR/Cas9修復(fù)免疫缺陷的臨床試驗。
　　2018年8月，歐洲多個國家批準(zhǔn)了張鋒的CRISPR Therapeutics公司的用CRISPR/Cas9治療β地中海貧血癥的臨床試驗。
　　2018年11月，解放軍總醫(yī)院的基于基因編輯T細(xì)胞治療癌癥的臨床試驗申請也被通過。
　　更遑論2018年11月份，原南方科技大學(xué)副教授賀建奎公然宣布自己做出了人類首例基因編輯嬰兒。細(xì)思極恐的是，賀建奎之后，居然還有不少力挺他的聲音，其中不乏國際最頂尖的科學(xué)家。
　　張鋒和David Liu等等也是極大地加快了基因編輯臨床化的速度。
　　畢竟，誰第一個取得了臨床化基因編輯的突破，誰就率先霸占了一塊醫(yī)療的制高點(diǎn)，這其中的利益真的太誘人了。乃至一時之間萬馬奔騰，有些人似乎已經(jīng)不在乎這其實還是一項風(fēng)險未知的技術(shù)了。
　　突然之間，左二偉博士乃至整個楊輝實驗室都好像無意中站在了歷史的節(jié)點(diǎn)上，這個隨手做做的課題突然將會變得足以決定這個領(lǐng)域的歷史走向——
　　檢測出來如果證明基因編輯不易脫靶當(dāng)然皆大歡喜，但如果證明它容易脫靶呢？且不說楊輝自己實驗室里那些涉及基因編輯向臨床轉(zhuǎn)化的課題將面臨考驗，還可能由此在行業(yè)內(nèi)掀起一場地震。
　　最終，左二偉博士在與導(dǎo)師楊輝研究員以及所長蒲慕明等人商議后，大家還是決定繼續(xù)做下去，畢竟……
　　得有人站出來承擔(dān)這個責(zé)任呀。
　　檢測脫靶，阻礙重重
　　阻礙檢測脫靶率的，除了“個體差異”外，還有另一個障礙。
　　什么障礙呢？我們繼續(xù)用射擊做比方：能得分的目標(biāo)靶子通常是唯一的，而目標(biāo)外的“別人家的靶子”可就是千千萬萬各有不同了。想象一下，如果隨便撒一把CRISPR/Cas9去編輯十萬個細(xì)胞的基因，假設(shè)每個都脫靶，且這些脫靶都是隨機(jī)產(chǎn)生的，那么這十萬個細(xì)胞最多就會有十萬種脫靶，每一種脫靶形式只占了所有樣本的十萬分之一，這種微乎其微的異常幾乎不可能被檢測出來。
　　因此，脫靶檢測需要依賴所謂的“單細(xì)胞測序”，通俗來說，就是實驗組和對照組都只有一個細(xì)胞。這樣的對比當(dāng)然就能很容易發(fā)現(xiàn)差別，但是很顯然，一個細(xì)胞那一丁點(diǎn)DNA是根本不夠拿來檢測的。為了解決這個矛盾，就要用到“體外擴(kuò)增”技術(shù)，把那一丁點(diǎn)DNA樣本復(fù)制成千上萬份，直到數(shù)量滿足檢測所需為止。
　　但是，人類發(fā)明的任何體外擴(kuò)增體系都是不完美的，無法做到100%精確拷貝最初的DNA樣本，每一次復(fù)制都會帶入一丁點(diǎn)錯誤。就像復(fù)印文稿總比原稿品質(zhì)差一些一樣，經(jīng)過千萬次復(fù)制再復(fù)制，就足以讓這份DNA樣本變得面目全非，干擾檢測結(jié)果。
　　這一切引入的“噪音”甚至比脫靶信號本身還要高出好幾個數(shù)量級，這宛如是在汪洋大海中尋找一滴水一般。
　　一舉三得該如何實現(xiàn)？
　　找到這滴水的唯一辦法就是讓大海（各種干擾因素）消失。左二偉博士與導(dǎo)師楊輝還真的想到了一種絕妙的方式，同時解決了這三個問題。
　　為了避免個體差異，我們又需要找到兩個基因一模一樣的細(xì)胞，為了凸顯脫靶的信號，我們又需要用到“單細(xì)胞測序”，然后我們還不能用體外擴(kuò)增來復(fù)制這兩個細(xì)胞的DNA，卻又需要很大量的DNA樣本來做測序分析。
　　首先最容易解決的就是找兩個基因完全一模一樣的細(xì)胞。我們知道，多數(shù)動物都是從一個受精卵發(fā)育而來的，這個受精卵一分為二，二分為四……等等，在它一分為二的時候，我們稱之為“二細(xì)胞期胚胎”階段，不就是兩個現(xiàn)成的基因一模一樣的細(xì)胞嗎？

　　只要向其中一個注射基因編輯工具，另一個就是世界上最佳的對照。

　　其次，一個細(xì)胞的DNA不是不夠檢測么？沒關(guān)系，注射完畢后我們直接把這個二細(xì)胞胚胎植入母鼠的子宮當(dāng)中，讓它正常發(fā)育，這樣得到的小鼠胚胎中，理論上就有一半細(xì)胞經(jīng)歷過基因編輯，另一半則沒有經(jīng)歷過過。
　　這時候，左二偉博士直接將發(fā)育長大的小鼠胚胎取出來，用一些特殊的酶消化成一大堆分散的細(xì)胞。利用一些方法，我們可以追蹤當(dāng)時那兩個細(xì)胞的后代，從這一堆細(xì)胞中將它們倆各自的后代分成兩撥。由于這兩撥細(xì)胞也是之前的細(xì)胞分裂而來，所以它們的基因就相當(dāng)于是最初那個細(xì)胞的復(fù)制品。
　　這也順便解決了第三個問題，裂解掉這一大堆足以構(gòu)建出半個小鼠胚胎的巨量細(xì)胞，一次性就能提取到足夠測序分析的DNA，從而避免了體外擴(kuò)增帶來的噪音。
　　在神經(jīng)所蒲慕明所長的建議下，研究團(tuán)隊將這套系統(tǒng)命名為GOTI?？梢哉f，這套系統(tǒng)的推出，標(biāo)志著人們終于得以用數(shù)字來衡量基因編輯的脫靶率。

　　GOTI的技術(shù)流程：在二細(xì)胞期向一個卵裂球注射基因編輯工具，并用CRE使之本身以及后代細(xì)胞都發(fā)出紅色熒光。等小鼠胚胎發(fā)育到14.5天后取出母體，利用流式細(xì)胞儀將兩個卵裂球的后代分開，并各自全部消化掉提取DNA來做測序分析。
　　哪種基因編輯易脫靶？我們挨個測一下
　　終于到了檢測工具一顯身手的時候。它接下來要幫助人們回答的關(guān)鍵問題就是：那些常見的基因編輯工具真的會脫靶嗎？在GOTI的神威下，一切清晰了起來。
　　首先，值得慶幸的是，最經(jīng)典的spCas9系統(tǒng)經(jīng)受住了考驗。結(jié)果顯示，它引起異常基因突變的可能性不高于小鼠自身細(xì)胞分裂帶來的本底基因突變。就是說，從目前的檢測結(jié)果來看它是安全的。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成為目前最方便的基因編輯工具。圖片來源：origene.com

　　與此同時最令人大跌眼鏡的發(fā)現(xiàn)是，另一類叫做單堿基突變系統(tǒng)（Base Editor）的基因編輯工具有著異常高的脫靶率。所謂的單堿基突變系統(tǒng)，大致上可以理解為我們先設(shè)計一個只能精確靶向但不會切割DNA的Cas9蛋白，然后讓這個Cas9蛋白牽著一個能夠通過化學(xué)方法將某個堿基定向突變（比如A→T）的酶來給DNA鏈中引入點(diǎn)突變。
　　原本這套系統(tǒng)因為不會引入DNA斷裂，被視為特別安全的一類基因編輯技術(shù)，人們從來不覺得它會脫靶，之前的脫靶檢測也完全沒有發(fā)現(xiàn)它有任何脫靶的跡象。因此以劉如謙（David Liu）等為代表的一群科學(xué)家長期都在致力于將這項技術(shù)作為基因編輯向臨床進(jìn)軍的急先鋒。

　　通過檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的CRISPR/Cas9并沒有顯著的脫靶現(xiàn)象，但是單堿基編輯系統(tǒng)BE3則出現(xiàn)了高出背景基因突變水平數(shù)倍的脫靶現(xiàn)象。
　　這時候研究團(tuán)隊才突然意識到，就算Cas9沒有在sgRNA帶領(lǐng)下跟任何DNA序列結(jié)合，那個能夠引起堿基定向改變的酶也依舊存在，它完全可以像任何在細(xì)胞里游離的酶一樣，讓任何偶然接觸自己的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。這樣的系統(tǒng)天然就有高脫靶率的，可能之前大家對“沒有DNA鏈斷裂就沒有脫靶”形成了思維定勢，才會忽視這一安全漏洞。
　　長久以來，因為缺少令所有人都信服的脫靶檢測技術(shù)，基因編輯的脫靶問題被吵吵嚷嚷了五年多，也讓這個領(lǐng)域在此期間一直處于野蠻生長的狀態(tài)。
　　如今，GOTI出現(xiàn)了，規(guī)則還會遠(yuǎn)嗎？

來源：我是科學(xué)家iScientist
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